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文獻解讀 | 環狀RNA位點的缺失可導致miRNA異常并影響大腦功能
科技服務 2015-11-26

文章來源:

發表在“Science”,影響因子37.205


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背景介紹

CircRNAs (Circular RNAs,環形RNA分子) 是一類不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環形結構的非編碼RNA分子。CircRNA是近年來RNA領域最新的研究熱點,它是前體RNA (pre-mRNA) 通過一種叫做反向剪接反應 (back-splicing) 的特殊選擇性剪接產生,在真核細胞中廣泛表達的環形內源性RNA分子。盡管被低效地加工,大多數呈低水平表達,但研究發現一些circRNAs源自與人類疾病相關的基因組位點,而且有越來越多的證據表明它們在轉錄、轉錄后及翻譯調控中的潛在作用。

成百上千的環狀RNA在哺乳動物的大腦中富集,通常表現為保守的表達。Cdr1as是一種在哺乳動物大腦中大量表達的環狀RNA,也是目前研究的最多的幾種環狀RNA之一,它可以作為miRNA的“吸收棉”,因為它有超過60個miRNA miR-7的結合位點,不過其具體作用依然不清楚。

Cdr1as,這種特定的circRNA能夠在興奮性神經元中發現但不在神經膠質細胞中發現。在小鼠和人類的大腦組織中,存在兩種結合到它上的microRNA:miR-7和miR-671。Cdr1as參與多種生物學過程,如:細胞凋亡、剪接過程、神經形成。


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解讀專欄

作者首先通過CLIP-Seq對miR-7嵌合體中的靶序列進行分析和排序,在小鼠和人大腦中,排在第一位的都是Cdr1as,與miR-7結合的RNA中排在第二位的是lncRNA Cyrano。能與Cdr1as結合的還有miR-671,但miR-7和miR-671跟Cdr1as的結合方式差異很大,Cdr1as有70個miR-7 結合位點,而只有一個很強的miR-671結合位點。通過RNA-FISH對不同的神經細胞用不同的熒光標簽進行區分,發現在皮質切片中Cdr1as只在神經元中表現出高表達,而且主要集中在興奮性神經元中,而在神經膠質細胞(少突膠質細胞和星形膠質細胞)中不表達。圖D展示的是利用CRISPR/Cas9敲除Cdr1as基因座,后續分別通過基因型、原位雜交、Northern blot和qRT-PCR驗證。


本文選取了高表達Cdr1as的小腦、皮質、海馬和嗅球等4個主要腦區進行miRNA seq。比較WT和KO小鼠4個腦區中的miRNAseq數據,并結合Northern blot,發現miR-7在KO小鼠中顯著下調。更加具體的情況是,miR-7a-5p和miR-7b-5p(它們的來源序列相同,成熟的RNA序列略有差別)在所有的腦區中均下調。與miR-7相反,在KO動物的小腦、皮質和嗅球中,miR-671-5p 表達上調。


如下圖所示,通過Northern blot、熒光原位雜交等方法進行驗證,miR-7在KO小鼠中表達顯著下調。


在上面4個腦區中檢測miRNA的同時做mRNA-seq。在皮質、小腦和嗅球中,一些保守的miR-7靶基因顯著上調,包括Fos、Nr4a3、Irs2、Klf4。此外,可與miR-7相互作用的lncRNA Cyrano在KO小鼠的4個腦區中都高表達。進一步對這些上調的基因進行審查,發現了一些顯著的IEGs,比如Fos、Arc、Egr1、Egr2、Nr4a3 等。用同一只動物和另外的動物中的皮質和海馬,通過qRT-PCR和Nanostring進行驗證,確認了所有的候選基因中,即早基因的蛋白表達水平升高。其中c-Fos、Egr1、Arc等通過Western Blot檢測,進一步通過免疫組織化學方法驗證c-Fos和Egr1在大腦切片中的表達。在四個腦區中對c-Fos的免疫組化結構進行定量,發現在KO小鼠中,表達c-Fos的神經元的數量增多,而且c-Fos信號強度更強。




利用單海馬神經元研究興奮性突觸后電流 (excitatory post synapticcurrents, EPSCs)。結果發現,在KO小鼠的神經元中,自發性的囊泡釋放顯著上調,微小興奮性突觸后電流頻率(而不是振幅)加倍。通過分析鈣離子誘發的突觸反應,發現KO與WT小鼠神經元相比,興奮性突觸后電流的振幅并沒有顯著不同。雖然計算得到的囊泡釋放概論沒有發生顯著改變,但是KO小鼠對兩個連續刺激的響應,以及對10Hz的動作電位序列的響應與WT小鼠顯著不同。

小鼠行為上有什么具體體現呢?分別對WT小鼠和KO小鼠進行行為學實驗KO小鼠的社會活動、焦慮水平、不受干擾的自發活動、在認知記憶或探索行為方面都沒有顯著的缺陷,但是唯獨驚嚇反應測試中,在三個不同的前脈沖強度下,前脈沖抑制 (prepulse inhibition,PPI) 顯示出很強的差異。


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研究結論及意義

1.Cdr1as主要在神經元中表達,幾乎不在膠質細胞中表達;

2.Cdr1as-KO小鼠大腦中miR-7顯著下調,miR-671顯著上調,其它組織中miR-7和miR-671表達變化不明顯;

3.Cdr1as的敲除顯示出與神經精神疾病相關的表型,比如PPI受損,而且IEGs很有可能參與其中。這些結果為今后的研究提供了很好的參考價值,也提供了很多可供挖掘的線索。


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